Identyfikacja czynników determinujących efektywność otrzymywania podwojonych haploidów żyta (Secale cereale L.) metodami androgenezy i krzyżowań oddalonych

Tytuł zadania

Identyfikacja czynników determinujących efektywność otrzymywania podwojonych haploidów żyta (Secale cereale L.) metodami androgenezy i krzyżowań oddalonych.

Numer zadania 84

(w załączniku nr 8 do Rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 29 lipca 2015 r. w sprawie stawek dotacji przedmiotowych dla różnych podmiotów wykonujących zadania na rzecz rolnictwa (Dz. U. z dnia 14.08. 2015r. Poz. 1170).

Streszczenie

Żyto jest zbożem ważnym ekonomicznie, zyskującym na znaczeniu w przemyśle paszowym i spożywczym. W ostatnich latach poczyniono postępy w tradycyjnej hodowli samopylnych form tego zboża. Proces ten jest jednak długotrwały i kosztowny. Nowoczesne metody biotechnologiczne, w tym haploidyzacja, mogą skrócić czas otrzymywania homozygotycznych linii. Dotychczas, u żyta, do uzyskiwania haploidalnych roślin stosowano androgenezę (kultury pylników i izolowanych mikrospor) oraz sporadycznie krzyżowania oddalone. Niestety, w efekcie ponad 40-letnich badań nad haploidyzacją genomu żyta, nie opracowano efektywnej metody produkcji podwojonych haploidów (ang. doubled haploids, DH) u tego gatunku. Nie określono przyczyn ‘oporności’ na indukcję oraz regenerację DH. Z tych względów, bardzo istotna jest identyfikacja czynników warunkujących zwiększoną efektywność haploidyzacji w kulturach in vitro żyta.

Celem nadrzędnym proponowanego projektu jest określenie przyczyn braku podatności oraz identyfikacja czynników warunkujących przełamanie barier haploidyzacji żyta z wykorzystaniem dwóch metod: androgenezy w kulturach pylników i izolowanych mikrospor oraz krzyżowań oddalonych żyta z kukurydzą (Secale cereale L. ssp. cereale x Zea mays L.). Celami pośrednimi są: (1) wybór optymalnej metody indukcji haploidalnych zarodków żyta (androgenezy i/lub krzyżowań oddalonych), (2) ustalenie optymalnych warunków kiełkowania i regeneracji zarodków/kalusów dla uzyskania na drodze androgenezy i/lub krzyżowań oddalonych roślin diploidalnych (DH) żyta. W przypadku pozytywnej realizacji celów 1-2, postawiony będzie cel (3) związany z analizą fizjologicznego podłoża warunkującego efektywną produkcję DH żyta. W tym celu zbadana zostanie aktywność wybranych enzymów antyoksydacyjnych biorących udział w reakcji na stres związany z czynnikami indukującymi sporofitowy rozwój gametofitów. Ponadto, poszukiwany będzie związek pomiędzy programowaną śmiercią komórki (PCD) a podatnością/lub jej brakiem na indukcję sporofitowego rozwoju gametofitu. Weryfikacji poddana będzie hipoteza dotyczącą udziału glutationu (GSH) w regulacji przebiegu PCD. W efekcie pogłębiona zostanie wiedza dotycząca mechanizmów determinujących rozwój sporofitowy prowadzący do powstawania zarodków o wysokim potencjale regeneracyjnym.

Badania nad haploidyzacją genomu przeprowadzone zostaną na mieszańcach pokolenia F1 samopylnego żyta ozimego (Secale cereale L. ssp. cereale). Spośród testowanych metod w pierwszych latach realizacji projektu, wybrana zostanie najbardziej efektywna. Na tej podstawie dokonana będzie selekcja genotypów skrajnie zróżnicowanych pod względem podatności na haploidyzację, które wykorzystane będą, jako obiekty modelowe w badaniu fizjologicznego podłoża indukcji i regeneracji DH żyta. W ramach projektu przewiduje się sprecyzowanie odpowiedniej fazy rozwojowej kłosów z gametofitami męskim i/lub żeńskim. Zoptymalizowane będą warunki wstępnego traktowania kłosów, skład roztworów/pożywek oraz świetlno-termiczne warunki kultu in vitro. Do pomiaru aktywności wybranych enzymów wykorzystane będą techniki spektrofotometryczne. Do zbadania PCD wykorzystany będzie test TUNEL.

Uzasadnieniem celowości proponowanych badań jest fakt, że do tej pory nie prowadzono szczegółowych badań nad haploidyzacją żyta w rozbudowanych układach doświadczalnych. Wiedza merytoryczna oraz duże doświadczenie wykonawców projektu dają szansę na efektywną realizację postawionych celów.

 

Raport 2015

 

Projekt MRiRW, zadanie numer 84: Identyfikacja czynników determinujących efektywność otrzymywania podwojonych haploidów żyta (Secale cereale L.) metodami androgenezy i krzyżowań oddalonych.

Dotacja MRiRW: HOR hn-801-PB-14/15

 

Temat badawczy 1/2015: Ocena efektywności haploidyzacji żyta metodami androgenezy w kulturach pylników i izolowanych mikrospor oraz krzyżowań oddalonych z kukurydzą.

Temat badawczy 2/2015: Określenie odpowiedniej fazy rozwoju gametofitu oraz optymalizacja warunków indukcji haploidalnych zarodków żyta w wybranej w Zb1 metodzie.

 

Żyto jest zbożem ważnym ekonomicznie, zyskującym na znaczeniu w przemyśle paszowym i spożywczym. W ostatnich latach poczyniono postępy w tradycyjnej hodowli samopylnych form tego zboża. Proces ten jest jednak długotrwały i kosztowny. Nowoczesne metody biotechnologiczne, w tym haploidyzacja, mogą skrócić czas otrzymywania homozygotycznych linii. Dotychczas, u żyta, do uzyskiwania haploidalnych roślin stosowano androgenezę (kultury pylników i izolowanych mikrospor) oraz sporadycznie krzyżowania oddalone. Niestety, w efekcie ponad 40-letnich badań nad haploidyzacją genomu żyta, nie opracowano efektywnej metody produkcji podwojonych haploidów (ang. doubled haploids, DH) u tego gatunku. Nie określono przyczyn ‘oporności’ na indukcję oraz regenerację DH. Z tych względów, bardzo istotna jest identyfikacja czynników warunkujących zwiększoną efektywność haploidyzacji w kulturach in vitro żyta.

Celem nadrzędnym proponowanego projektu było określenie przyczyn braku podatności oraz identyfikacja czynników warunkujących przełamanie barier haploidyzacji żyta z wykorzystaniem dwóch metod: androgenezy w kulturach pylników i izolowanych mikrospor oraz krzyżowań oddalonych żyta z kukurydzą (Secale cereale L. ssp. cereale x Zea mays L.). Celami pośrednimi były: (1) wybór optymalnej metody indukcji haploidalnych zarodków żyta (androgenezy i/lub krzyżowań oddalonych), (2) ustalenie optymalnych warunków kiełkowania i regeneracji zarodków/kalusów dla uzyskania na drodze androgenezy i/lub krzyżowań oddalonych roślin diploidalnych (DH) żyta.

Badania nad haploidyzacją genomu przeprowadzono mieszańcach pokolenia F1 (samopylnego oraz obcopylnego) żyta ozimego (Secale cereale L, ssp. cereale) udostępnionych przez polskie spółki hodowli roślin. Testowano metody: androgenezy w kulturach pylników i izolowanych mikrospor oraz krzyżowań oddalonych żyta z kukurydzą.

Scharakteryzowano testowane techniki haploidyzacji w indukcji zarodków (kultury pylnikowe, izolowanych mikrospor oraz krzyżowań oddalonych z kukurydzą) i wybrano najbardziej efektywną metodę. Na tej podstawie dokonano selekcji genotypów skrajnie zróżnicowanych pod względem podatności na haploidyzację, które wykorzystane będą, jako obiekty modelowe w badaniu fizjologicznego podłoża indukcji i regeneracji DH żyta na dalszych etapach projektu. W ramach zadań badawczych określono: (1) optymalną fazę rozwoju gametofitu żeńskiego do indukcji haploidalnych zarodków żyta w metodzie krzyżowań oddalonych. Wykazano, że na efektowność metody krzyżowania oddalonego u żyta ma wpływ przede wszystkim genotyp, okres pomiędzy kastrowaniem a zapylaniem (4 lub 6 dni) oraz rodzaj stosowanej auksyny; (2) optymalną fazę rozwoju gametofitu męskiego do indukcji haploidalnych zarodków żyta w androgenezie. Wykazano wpływ genotypu roślin macierzystych i rodzaju wstępnego traktowania kłosów na żywotność oraz na średnią ilość poszczególnych typów komórek, będących w optymalnym stadium do zainicjowania androgenezy (w stadium jednojądrowym) oraz komórek inicjujących rozwój sporofitowy (po symetrycznym podziale) w dniu izolacji z kłosów. Traktowanie kontrolne kłosów chłodem, indukowało symetryczne podziały w mikrosporach wszystkich badanych genotypów. Zastosowane modyfikacje podtrzymywały żywotność komórek oraz inicjowały symetryczne podziały.

(3) Wykazano, że zastosowane w androgenezie (kultury pylników oraz izolowane mikrospory) traktowania wstępne, ich kombinacje (niska temperatura, stres osmotyczny, łagodzenie stresu oksydacyjnego) oraz modyfikacje składu pożywek indukcyjnych, istotnie wpłynęły na indukcję procesu androgenezy u żyta. W kulturze pylników, u 14/15 obiektów udało się uzyskać struktury androgeniczne. Czynnikiem różnicującym większość parametrów efektywności androgenezy (np. liczba struktur androgenicznych AS w przeliczeniu na 100 pylników P; AS/100P) był genotyp i/lub interakcja pomiędzy genotypem, pożywką a wstępnym traktowaniem. Efektywność indukcji androgenezy w kulturze zawiesinowej mikrospor również miała silne podłoże genotypowe. Średnia efektywność androgenezy, wyrażona parametrem AS/10^5 MCS (liczba struktur androgenicznych AS w przeliczeniu na 105 mikrospor MCS), dla genotypów charakteryzujących się wysoką odpowiedzią androgeniczną, była prawie 2,5-razy wyższa niż u genotypów scharakteryzowanych, jako średnio podatne i prawie 32-razy wyższa jak u genotypów opisanych, jako oporne.

Efektywność regeneracji struktur androgenicznych uzyskanych w kulturach pylników i izolowanych mikrospor różniła się w zależności od traktowania wstępnego kłosów. Wyższą efektywność regeneracji (nawet o 24 razy) uzyskano, bez względu na rodzaj pożywki i warunki termiczne kultury in vitro w kulturach pylników. W sumie, uzyskano dziesięć zielonych regenerantów, które poddano analizie ploidalności w cytometrze przepływowym. Wykazano, że 60% roślin spośród badanych genotypów jest dihaploidami. Rośliny te charakteryzowała liczba chromosomów 2n. Wśród pozostałych 40% zielonych regenerantów znajdowały się rośliny haploidalne oraz miksoploidalne.

Sprawozdanie 2016

Sprawozdanie 2017