Analiza stabilności epi-genomowej linii addycyjnych owsa z kukurydzą

Linie addycyjne owsa z kukurydzą (ang. OMA lines, oat × maize addition lines), powstające na drodze
krzyżowania oddalonego, stanowią unikatowy materiał badawczy z sukcesem wykorzystywany w
cytogenetycznym systemie mapowania genomu kukurydzy czy analizie ekspresji genów. Jednak obecność
chromosomu/ów kukurydzy często prowadzi do aberracji morfologicznych i fizjologicznych, których
charakter zależy od konkretnego chromosomu/ów kukurydzy wbudowanych w genom owsa oraz od genotypu
owsa. Niestety wiedza o mechanizmie tego niezwykłego zjawiska jest nadal fragmentaryczna.
W wyniku badań prowadzonych w Zakładzie Biotechnologii Roślin IFR PAN w Krakowie otrzymano
kilkadziesiąt linii OMA, u których wykorzystując genomową hybrydyzację in situ potwierdzono obecność
chromosomów kukurydzy1. Zbadano fenotyp uzyskanych mieszańców oraz wykazano, że w jądrach
interfazowych mieszańcow chromatyna kukurydzy występuje na obrzeżach jądra2. Dane literaturowe
wskazują, że linie addycyjne np. pszenicy z żytem, cechują się obniżoną stabilnością genomową oraz tendencją
do eliminacji obcej chromatyny z genomu gospodarza. Dlatego, dysponując liniami OMA zasadnym wydaje
się (1) ocena ich stabilności genetycznej, (2) zbadanie topologii chromatyny w jądrach komórkowych
mieszańców oraz (3) analiza wybranych modyfikacji epigenetycznych. Do realizacji pierwszego celu posłużą
rozgniotowe preparaty mikroskopowe z merystemów wierzchołkowych korzenia. Do podbarwienia
chromatyny wykorzystany zostanie odczynnik Schiffa, a następnie oceniona będzie ilość chromosomów,
obecność mikrojąder oraz mostów chromatynowych między jądrami komórkowymi. Przesłanką do
zaproponowania drugiego zadania badawczego jest informacja, iż owies posiada konfiguracje chromatyny
Rabla, tzn. centromery i telomery znajdują się na przeciwległych biegunach jądra komórkowego, która nie
występuje w genomie kukurydzy. Analiza konfiguracji chromatyny przeprowadzona zostanie na podstawie
immunobarwienia z użyciem przeciwciała przeciwko centromerowo specyficznemu histonowi CENH3
wskazującego położenie centromerów wraz z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ z wykorzystaniem sond
genomowego DNA kukurydzy i sekwencji telomerowej. Projekt zakłada również przeprowadzenie oceny
modyfikacji epigenetycznych chromatyny w jądrach mieszańców. W tym celu, wykonane zostanie
immunobarwienie z wykorzystaniem wybranych represyjnych (H3K9me2, H3K37me3) i permisywnych
(H3K4me3, H3K36me3) potranslacyjnych modyfikacji histonów. Dodatkowo oceniony zostanie poziom
metylacji DNA. Kompleksowa realizacja tematu dostarczy fundamentalnych informacji na temat stabilności
genomowej mieszańców owsa z kukurydzą oraz znacząco pogłębi wiedzę z zakresu powstawania i
funkcjonowania międzygatunkowych hybryd. Otrzymane wyniki umożliwią ocenę potencjału
międzygatunkowych mieszańców do wykorzystania zarówno w badaniach podstawowych jak i aplikacyjnych
(np. tworzenie nowych odmian dla rolnictwa).
Materiał badawczy stanowić będą linie OMA, jako kontrola wykorzystany zostanie owies „Bingo”
oraz kukurydza „Waza”. Zaplanowane analizy przeprowadzone zostaną w komórkach somatycznych
merystemu wierzchołkowego korzenia.
Idealnym miejscem do przeprowadzenia eksperymentów zaplanowanych w przedkładanym projekcie
jest Centrum Genomiki Strukturalnej i Funkcjonalnej Roślin Instytutu Botaniki Doświadczalnej (IEB) w
Ołomuńcu, którego kierownikiem jest prof. Jaroslav Doležel. Instytut dysponuje cytometrami przepływowymi
połączonym z sorterami (FACSVantage, FACSAria SORP) oraz mikroskopami: fluorscencyjnymi (Zeiss) i
konfokalnym Leica z modułem super-rozdzielczości (Leica TCS SP8 STED 193 3X). Dodatkowo, IEB
posiada w pełni wyposażone laboratoria biologii molekularnej i cytogenetyki. Oprócz doskonałego zaplecza
technicznego, wybrany ośrodek badawczy zrzesza wybitnych naukowców, których wiedza i doświadczenie w
zakresie proponowanej tematyki będzie nieocenioną pomocą podczas realizowania proponowanych zadań i
równocześnie gwarantem pomyślnego przeprowadzenia zaplanowanych eksperymentów. Prace realizowane
będą w międzynarodowej grupie badawczej dr Alesa Pečinki (h-index 22), który od lat specjalizuje się w
tematyce organizacji chromatyny w genomie roślinnym. Realizacja proponowanego działania naukowego w
IEB pozwoli na zdobycie wiedzy i umiejętności w zakresie najnowszych technik, a dzięki temu zapewni
możliwość istotnego poszerzenia dotychczasowej tematyki badawczej o zupełnie nowe zagadnienia i metody
badawcze. Dla wnioskodawcy współpraca z tak znakomitym zespołem naukowców będzie stanowić
strategiczny punkt w rozwoju kariery naukowej – nie tylko podniesie rangę badań prowadzonych w jednostce
macierzystej, ale także poziom opracowywanych publikacji i tym samym przyczyni się do zgromadzenia
wartościowego dorobku habilitacyjnego.

Wyniki przedkładanego projektu będą stanowić podstawę do dalszych, bardziej szczegółowych analiz nad
mechanizmami powstawania i funkcjonowania mieszańców międzygatunkowych.
Tworzenie mieszańców owsa z kukurydzą stanowi niezwykle interesujące zagadnienie stwarzające
możliwość rozwinięcia zupełnie nowych kierunków badań. Aktualna wiedza na temat introgresji
chromosomów oraz jej konsekwencji dla struktury i ewolucji mieszańców międzygatunkowych jest bowiem
wciąż fragmentaryczna. Dlatego też konieczne są dalsze prace, które przyczynią się do poznania mechanizmu
tego intrygującego biologicznie zjawiska.
Kolejne eksperymenty powinny służyć wyjaśnieniu: (I) czynników decydujących o liczbie i rodzaju
zachowywanych chromosomów kukurydzy, (II) możliwości kontroli liczby zatrzymanych chromosomów (np.
przez manipulacje czynnikami zewnętrznymi), (III) które krzyżowania spowodują stabilną introgresję
pożądanych cech w hodowli roślin, (IV) poziomu ekspresji informacji z chromosomów kukurydzy w genomie
owsa, (V) problemu sterylności mieszańców, (VI) możliwości stworzenia nowego gatunku odznaczającego się
korzystnymi właściwościami biologicznymi, żywieniowymi i agronomicznymi, jak np. w przypadku
Tritordeum – mieszańca pszenicy twardej (Triticum durum) i dzikiego jęczmienia (Hordeum chilense),
wprowadzonego w 2013 roku na rynek przez spółkę Agrasys (Barcelona, Hiszpania).