Wpływ suszy glebowej na proteom chloroplastów jęczmienia ozimego (Hordeum vulgare L.)
Susza glebowa poważnie ogranicza produkcję roślinną, powodując znaczne straty plonów i obniżenie ich jakości. Prognozy przewidują, że szybko postępujące zmiany klimatu nasilą częstotliwość i intensywność występowania niedoborów wody w podłożu. Utrzymanie stabilnej produkcji roślinnej w niekorzystnych warunkach środowiskowych stanowi obecnie priorytet w badaniach nad roślinami uprawnymi, zwłaszcza zbożami zajmującymi największy areał upraw na świecie. Jęczmień, będący jedną z ważniejszych roślin zbożowych stanowi jednocześnie doskonały model do badań nad mechanizmami odporności zbóż na stresy środowiskowe ze względu na jego diploidalny charakter i poznany genom. Ponadto gatunek ten wykazuje duże zróżnicowanie poziomu odporności na niekorzystne warunki środowiska w obrębie gatunku.
Niedobór wody w glebie kiedy liść flagowy roślin zbożowych jest w pełni rozwinięty, znacząco ogranicza ich produktywność. Liść ten dostarcza bowiem asymilaty rozwijającemu się kwiatostanowi, a potem odżywia zawiązujące się ziarniaki. Analiza proteomu liścia flagowego jęczmienia ozimego wykazała, że stres suszy wywiera znaczący wpływ na akumulację białek związanych z fotosyntezą, a poziom ich akumulacji różni się istotnie w zależności od odporności roślin na stres. Co więcej, niezwykle istotna jest nie tylko tolerancja na dehydratację tkanek w trakcie deficytu wody, ale również zmiany zachodzące w trakcie rehydratacji, po przywróceniu optymalnego poziomu uwodnienia podłoża. Większość białek uczestniczących w procesie fotosyntezy jest zlokalizowana w chloroplastach, dlatego analiza proteomu tego organellum może dostarczyć ważnych informacji dotyczących mechanizmu determinacji poziomu tolerancji na stres suszy.
Głównym celem zaplanowanego projektu badawczego jest identyfikacja białek chloroplastowych, zaangażowanych w procesy uruchamiane w odpowiedzi suszę i warunkujące tolerancję na ten czynnik stresowy. Materiał do badań będą stanowiły cztery linie podwojonych haploidów (ang. doubled haploid; DH) jęczmienia ozimego, po dwie linie wrażliwe i tolerancyjne na suszę, wyselekcjonowane na podstawie wcześniejszych badań. Linie DH są idealnymi obiektami modelowymi ze względu na ich pełną homozygotyczność, a z tym wiąże się zmniejszony zakres zmienności fenotypowej roślin w obrębie linii. Rośliny jęczmienia będą uprawiane w kontrolowanych warunkach szklarniowych. Po rozwinięciu się liści flagowych, podlewanie roślin zostanie ograniczone do momentu kiedy uwodnienie podłoża w wazonie wegetacyjnym będzie wynosić 30-35% polowej pojemności wodnej (ppw). Zmiany w proteomach liści flagowych będą analizowane w ostatnim dniu 3-tygodniowej suszy oraz po 3 dniach od momentu przywrócenia optymalnego uwodnienia podłoża (tj. 75% ppw). Analiza chloroplastowego proteomu zostanie wykonana z wykorzystaniem metod elektroforezy dwukierunkowej oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas wysokiej rozdzielczości (LC-MS/MS). Z pobranych liści flagowych będą wyizolowane chloroplasty, z których następnie zostaną ekstrahowane białka metoda fenolową. Rozdział mieszaniny białek zostanie przeprowadzony z wykorzystaniem techniki ogniskowania izoelektrycznego, a następnie z użyciem elektroforezy w warunkach denaturujących. Rozdzielone białka będą wybarwione koloidalnym roztworem błękitu Coomasie i zdigitalizowane. Otrzymane mapy białkowe zostaną poddane analizie bioinformatycznej pozwalającej na zidentyfikowanie plamek białek na żelach, różnicujących chloroplastowe proteomy roślin tolerancyjnych od wrażliwych na stres suszy. Wyselekcjonowane plamki białek będą zidentyfikowane metodą LC-MS/MS. Uzyskane wyniki analizy proteomu chloroplastów jęczmienia zostaną potwierdzone analizą Western blot.
Analizom proteomicznym będą towarzyszyć analizy fenotypu roślin. Wykonane zostaną pomiary parametrów charakteryzujących poziom uwodnienia liści flagowych (potencjału wodny i względnej zawartości wody), intensywności fotosyntezy mierzonej wymianą gazową oraz parametrów fluorescencji chlorofilu a. Po zakończeniu okresu wegetacyjnego zostanie wykonana analiza wysokości plonu oraz wybranych komponentów składowych plonu, takich jak liczba kłosów wytworzonych przez rośliny, długość poszczególnych kłosów, liczba ziarniaków w kłosie oraz masa 1000 ziaren.
Zaplanowane badania pozwolą na identyfikację chloroplastowych białek uczestniczących
w kształtowaniu poziomu tolerancji na stres suszy i determinujących plonowanie jęczmienia ozimego po wystąpieniu okresowego niedoboru wody w glebie, w czasie wzrostu. Otrzymane wyniki umożliwią przystąpienie do badań nad mechanizmami regulującymi syntezę i aktywność wybranych, kluczowych białek.