Opracowanie efektywnego sposobu wytwarzania podwojonych haploidów metodą androgenezy dla polskich materiałów hodowlanych pszenicy (Triticum aesitivum L.)

Projekt  Tango2/340285/NCBR/2017

Streszczenie projektu: Proces androgenezy polega na uruchomieniu alternatywnej drogi rozwoju prowadzącej do odtworzenia całego organizmu rodzicielskiego w mikrosporach, haploidalnych (n) komórkach męskiego gametofitu, które natywnie zaprogramowane są do rozwoju w ziarna pyłku. Dojrzałe ziarna pyłku uczestniczą w procesie podwójnego zapłodnienia i powstawania zygoty zawierającej genomy obu rodziców, z której następnie rozwija się diploidalny (2n) zarodek. W warunkach in vitro, mikrospory mogą zainicjować alternatywną drogę rozwoju, tzw. proces androgenezy/embriogenezy mikrospor. Czynnikiem inicjującym ten proces jest stres, a jego efektem jest powstanie, z pominięciem procesu zapłodnienia, zarodka androgenicznego, zawierającego jedynie pojedynczy, haploidalny genom (n). Haploidalny zarodek poddaje się następnie regeneracji na sztucznych podłożach hodowlanych, tak by uzyskać roślinę z prawidłowo wykształconymi wierzchołkami: apikalnym (stożek wzrostu pędu) i bazalnym (stożek wzrostu korzenia). Końcowym efektem indukcji androgenezy oraz regeneracji są tzw. podwojone haploidy (DH), uzyskiwane poprzez spontaniczne lub wymuszone podwojenie liczby chromosomów haploidalnych regenerantów. Organizmy te, jako całkowicie homozygotyczne, są niezwykle cennymi modelami w badaniach podstawowych, biotechnologii i inżynierii genetycznej. Największe korzyści uzyskuje się jednak przy włączaniu linii DH w procesy hodowlane, gdyż całkowita homozygotyczność jest w hodowli cechą niezwykle pożądaną. Osiągnięcie jej metodami klasycznymi jest praktycznie niemożliwe. Wysoki stopień homozygotyczności jest cechą niezbędną przy rejestracji nowo wyprowadzanych odmian i uzyskiwany jest zazwyczaj poprzez cykl kolejnych, od kilku- do kilkunastoletnich krzyżowań wsobnych i selekcji. Skrócenie cyklu hodowlanego o kilka lat może mieć bardzo duże znaczenie dla konkurencyjności firm hodowlanych. Obecnie, dla pszenicy (Triticum ssp.) będącej obiektem planowanych badań, możliwe jest uzyskanie linii DH, jednakże stosowana metodyka wykorzystuje zazwyczaj tzw. krzyżowania oddalone, wymagające skomplikowanych procedur oraz wysokich nakładów czasu, pracy i kosztów. Zagraniczne firmy hodowlane, mające w swojej ofercie komercyjną produkcję linii DH tego gatunku, prawdopodobnie posiadają efektywne procedury wykorzystujące proces androgenezy, jednakże są one objęte klauzulą tajności i nie zostały upublicznione. Stosowane standardowe metody, które najczęściej opracowywane były dla pojedynczego i stosunkowo podatnego genotypu, są zazwyczaj powielane pomimo znikomej skuteczności w przypadku szerokiego spektrum materiałów hodowlanych. Nawet wysoka efektywność indukcji procesu androgenezy, wyrażana liczbą uzyskiwanych zarodków androgenicznych tzw. embryo-like structures (ELS), obserwowana w przypadku nielicznych genotypów nie przekłada się na wysoką efektywność końcową (liczbę zielonych roślin DH). Jest to efektem niskiej zdolności regeneracyjnej uzyskiwanych struktur oraz wysoką frekwencją roślin albinotycznych (pozbawionych barwników chlorofilowych, a przez to niezdolnych do funkcjonowania poza kulturami in vitro) w obrębie uzyskiwanego potomstwa DH. Wprowadzane modyfikacje, dotyczą zwykle pojedynczych czynników (fizycznych i chemicznych), które w niewielkim stopniu wpływają na efektywność procesu, bądź też podnoszą efektywność w sposób selektywny dla poszczególnych genotypów. Proponowane badania mają na celu kompleksową optymalizację kolejnych etapów procedury, która zapewni znaczącą poprawę efektywności technologii DH dla szerokiego spektrum cennych materiałów hodowlanych.
Czynnikiem uruchamiającym alternatywny programu rozwoju mikrospor jest stres, a dalsze fazy rozwoju wymagają przeniesienia do warunków in vitro i zapewnienia wszystkich substancji oraz czynników niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania, różnicowania i regeneracji. Zarówno rodzaj czynników stresowych, intensywność stresu, czas traktowania, jak i warunki kultury in vitro wymagają precyzyjnej optymalizacji i determinują efektywność procesu androgenezy czyli ilość uzyskiwanych linii DH. W ramach projektu przewiduje się analizę wpływu różnorodnych czynników (niska lub wysoka temperatura, stres osmotyczny, stres głodowy) i ich kombinacji, oraz czasu trwania i intensywności stresu, która umożliwi selekcję optymalnych warunków traktowania wstępnego, inicjującego proces androgenezy. Zastosowane zostaną substancje ograniczające poziom stresu oksydoredukcyjnego i stymulujące aktywność systemu antyoksydacyjnego mikrospor, czynniki modyfikujące endogenny poziom substancji hormonalnych, czynniki stymulujące biosyntezę barwników chlorofilowych oraz substancje regulujące inicjację procesu programowanej śmierci komórek (apoptozy). Nieliczne doniesienia, potwierdzające istotną rolę potencjału oksydoredukcyjnego komórek oraz korzystny wpływ antyoksydantów, można znaleźć w literaturze światowej, m.in. autorstwa zespołu naukowego IFR PAN. Jednakże zarówno badania, jak i różnorodne modyfikacje wprowadzane były dotychczas na etapie kultur in vitro. Po raz pierwszy, modyfikacjom podlegać będzie wstępna faza indukcji procesu, co skutkować powinno podniesieniem żywotności komórek i ich tolerancji na stres już w trakcie izolacji i przenoszenia do warunków in vitro. Zoptymalizowane zostaną również warunki indukcji in vitro, regeneracji i ukorzeniania uzyskanych roślin DH, co pozwoli na podniesienie efektywności regeneracji zielonych regenerantów oraz częstotliwości spontanicznych podwojeń genomu. Na podstawie najnowszych doniesień literaturowych oraz wyników badań własnych zespołu naukowego IFR PAN wyselekcjonowane zostaną i po raz pierwszy wykorzystane w kulturach in vitro niektóre substancje/czynniki o charakterze biostymulatorów poprawiające efektywność regeneracji i ukorzeniania zielonych roślin DH.
Ostatnie wyniki badań własnych oraz najnowsze dane literaturowe sugerują, iż znacząca poprawa efektywności androgenezy jest wysoce prawdopodobna. Co więcej, uzyskane wyniki i wnioski z nich wypływające powinny mieć charakter uniwersalny i mogą znaleźć zastosowanie również w przypadku innych gatunków roślin, dla których do chwili obecnej nie opracowano efektywnych procedur indukcji androgenezy.